摘要：由于传统方法在检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌需要48小时左右,且操作过程复杂,难以掌握。现介绍一种快速简便的检测方法，根据生活饮用水卫生标准（GB/T 5750-2006）中推荐的固定底物技术酶底物法可购买到市售化产品西安海研生物科技有限公司的Colitech试剂。用于检测100ml水样，只需手工操作2分钟，即可在24小时内同时定量检测出大肠菌群和大肠埃希氏菌。此方法大大的减少了工作量，避免了使用多管法的逐级稀释带来的操作误差；也避免了使用滤膜法时肉眼读数的人为误差，所以其假阳性率和假阴性率都比传统方法低。由于24小时内就得到结果，可以很好的用于突发事件应急。

1. 背景：

目前我国对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生学评价，检测的指标为大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群（耐热大肠菌群），以这些指标作为粪便污染的指示菌。采用的标准检测方法为膜过滤法和多管发酵法。但这两种方法检测时间相对较长，需48—72小时，需验证试验，试验步骤较为繁琐，所以不能对水的卫生学状况做出快速评价。因此，采用快速简便的检测方法很必要。固定地物技术酶底物法可以较好的弥补传统方法的不足。

主要内容：

1、实验原理

2、仪器设备与试剂耗材

3、实验步骤

4、讨论与分析

2. 原理：

固定底物技术酶底物法（Defined Substrate Technology）采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。固定底物技术酶底物法可以选用国标中推荐粉状培养基（西安立科公司的酶底物试剂）来进行简便的操作；无需确认试验；固定底物技术酶底物法检测时间短，只需24小时即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。

3. 试剂和设备：

3.1 试剂：采用固定底物技术酶底物法市售化的MMO-MUG（Minimum Media ONPG-MUG）培养基—酶底物试剂。

3.2 耗材：取样瓶或使用灭菌的玻璃；51孔定量盘或97孔定量盘。

注：51孔定量盘可在无需稀释的情况下检测1—200个目标菌/100ml水样；97孔定量盘可在无需稀释的情况下检测1—2419个目标菌/100ml水样。

3.3 设备：定量程控封口机；366nm紫外灯；阳性对照物 。

注：海研sea plus定量程控封口机除了将定量盘进行封口外还对100ml水样平均分配到51个孔或者是97个孔中。

4. 操作方法：

4.1 定性检测：

4.1.1 适用范围：

一般用于检测饮用水、瓶装水等；这些水样的结果是不得检出。所以只需用定性检测就可满足试验要求。

4.1.2 操作步骤：

1) 将一个酶底物试剂倒入装有100ml水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。

2) 放在36±1℃培养箱，培养24小时；

注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在44.5℃，培养24小时；如果培养时间超过28小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则结果无效，需重做此水样。

3) 根据下面的结果解释读取结果

4) 无需确认试验

4.2 定量检测

4.2.1 适用范围：适用于任何一种水体。

4.2.2 操作步骤：

1) 将一个酶底物试剂倒入装有100ml水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。

2) 将瓶内的水样全部倒入51孔或者是97孔定量盘中，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后使用定量程控封口机进行封口。

3) 将定量盘放在36±1℃培养箱，培养24小时 。

注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在44.5℃，培养24小时；如果培养时间超过28小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则结果无效，需重做此水样。

4) 根据下面的结果解释读取结果。数出阳性格子数后对照MPN表得到结果。

5) 无需确认试验

5. 测量范围

5.1 最低检出限酶底物试剂可以在24小时同时检测出总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠菌群），它可以在100ml水样中抑制2百万个杂菌干扰，最低检出限为每100ml水样可检测出1cfu的总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。

5.2 选用51孔定量盘

在不稀释的情况下，100ml水样可检测200个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。

5.3 选用97孔定量盘

在不稀释的情况下，100ml水样可检测2419个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。

6 检测水样的范围

饮用水 、源水 、瓶装水 、中水 、二次供水 、管网水 、废水 、食品水 、畜牧用水 、医疗用水

7．实验过程中需注意的地方

如果样品有背景颜色，请做一个空白实验，与结果相比较，如果样品被稀释，则在读取MPN表时乘以相应的稀释倍数，只可使用纯水，不含缓冲的水，不含氧化剂的水进行样品稀释，如果样品中含有过多的氯，则在加入试剂时会显蓝光，此时样品应被终止检测。

8．结论

总大肠菌群细菌主要由以下4个菌属细菌组成：埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属。这些菌属可以在人、畜粪便中检出，有的也可以在营养丰富的水体中检出，即非粪便污染的情况下，也有检出这些细菌的可能性。粪大肠菌群组成与总大肠菌群组成相同，但主要组成是埃希菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希氏菌；柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属所占数量较少。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希氏菌检出的意义很大，其次是粪大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些， 固定底物技术酶底物法操作简便，检测时间短，可在24小时内同时检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌的污染状况且无需确认试验；减少了传统方法中人为操作的误差，能够更准地判断水样的微生物污染状况；作为饮用水卫生标准的新方法，不但可以用于水样的例行检测，更可作为应急突发事件的必备试剂。